Chromatographie

La chromatographie , la chromatographie (en grec , chroma "couleur" et graphein "écrire", en allemand écriture couleur ) est un procédé appelé en chimie qui permet de séparer un mélange de substances en répartissant différemment ses composants individuels entre un fixe et un mobile phase. Ce principe a été décrit pour la première fois en 1901 par le botaniste russe Mikhail Semjonowitsch Zwet , en 1903 il a été décrit en public pour la première fois, et en 1906 il a utilisé pour la première fois le terme "chromatographie". Il a examiné des extraits de plantes colorées, par exemple à partir de feuilles, et a pu en isoler divers colorants au moyen de la chromatographie. Cette méthode est utilisée d'une part en production pour la purification de substances (= chromatographie préparative), d'autre part en analyse chimique pour séparer des mélanges de substances en ingrédients aussi homogènes que possible à des fins d'identification ou de détermination quantitative. La Chromatographie est utilisée en chimie organique , la pharmacie , la biochimie , la biotechnologie , la microbiologie , la chimie alimentaire , de la chimie de l' environnement , ainsi que dans la chimie inorganique .

Principe de la chromatographie

La façon la plus simple d'expliquer la chromatographie est de faire une comparaison :

Une rivière déchaînée peut transporter pas mal de débris flottants. La vitesse à laquelle les débris flottants sont déplacés dépend de

• le type de débris flottants (les grains de sable sont transportés plus rapidement que les cailloux),
• la nature du lit de la rivière (les surfaces rugueuses augmentent le frottement des débris flottants et réduisent ainsi la vitesse d'enlèvement)
• sur la vitesse d'écoulement.

En chromatographie, différentes substances (= débris flottants) sont transportées dans la phase dite mobile (= eau) sur une phase stationnaire (= lit de rivière). En raison des interactions (voir la classification sous principes de séparation) entre l'échantillon, la phase stationnaire et la phase mobile , les substances individuelles sont transportées à des vitesses différentes et ainsi séparées les unes des autres : Un mélange de sable, de très petits et de galets légèrement plus gros est introduit en un point de la rivière ; au bout d'une centaine de mètres par exemple, tout le sable arrive en premier (réparti sur quelques mètres) et après un certain temps d'attente tous les petits cailloux et bien plus tard les plus gros, chacun écarte une certaine distance.

Cette comparaison convient pour une première introduction. En fait, le processus (en chromatographie) fait plutôt penser à un processus « numérique » (« stop and go »). Les molécules de l'échantillon sont soit entraînées avec la phase mobile (à la vitesse de la phase mobile - l'analogie serait un radeau qui serait transporté passivement dans un ruisseau), soit elles adhèrent à la phase stationnaire (vitesse égale à zéro). Ils basculent très rapidement entre ces deux possibilités (du fait du mouvement de la chaleur, ils reçoivent en permanence des chocs). La comparaison avec le lit de la rivière pourrait également conduire à un autre malentendu : les retards que subissent les différentes molécules de l'échantillon lors de leur passage dans le système chromatographique n'ont rien à voir avec des phénomènes de frottement . La base de compréhension sont les différences dans la distribution (des différents types de molécules A, B, C etc.). Ils correspondent à des différences dans la proportion de temps (que les molécules individuelles de type A, B, C etc. passent en moyenne dans la phase mobile). La chromatographie parvient à convertir ces différences en différences de vitesse et les rend ainsi utiles pour une séparation. Cela pourrait aussi être appelé le « truc » ou le principe de la chromatographie. Sinon, ces différences souvent très faibles pourraient difficilement être utilisées, ni pour les processus de séparation et de nettoyage, ni pour les analyses.

Il est plus facile de comprendre à l'aide d'un exemple : si 45% des molécules A sont dans la phase mobile (en moyenne), en raison de l'équilibre dynamique, les molécules A individuelles sont également dans la phase mobile 45% du temps Phase de dépense ( en moyenne). Par conséquent, leur vitesse sera de 45% de la vitesse de la phase mobile (en moyenne). Pour de bons résultats en chromatographie, il est crucial que l'échange de substances entre les deux phases se fasse très rapidement, c'est-à-dire que les molécules individuelles de l'échantillon doivent très souvent alterner entre les deux phases (processus de diffusion, mouvement de chaleur). Une condition préalable à cela est que les chemins que les molécules doivent parcourir de la phase stationnaire à la phase mobile soient très courts. Si la phase stationnaire contient une poudre, la granulométrie de cette poudre doit être très faible (par exemple quelques micromètres seulement). Pour certaines raisons, les grains de poudre doivent également avoir une forme aussi uniforme que possible et avoir une taille aussi uniforme que possible (distribution granulométrique étroite).

traiter

Pour la chromatographie, l'établissement du flux de la phase mobile, l'injection de l'échantillon à séparer, la séparation proprement dite et la détection sont nécessaires. L'écoulement de la phase mobile est réalisé soit par pression (pompe hydraulique, pression de gaz), soit par capillarité, soit par application d'une tension électrique.

L' injection (= introduction du mélange de substances dans le système chromatographique) a lieu soit avant que l'écoulement de la phase mobile ne soit établi (par exemple , chromatographie sur couche mince ) ou pendant que la phase mobile s'écoule déjà. Avec un grand nombre d'échantillons, des passeurs d'échantillons (avec leurs propres systèmes d'acquisition de données) sont utilisés avec des types de chromatographie automatisables, qui injectent les échantillons de manière entièrement automatique.

La séparation proprement dite du mélange de substances a alors lieu sur la section de séparation. Sans détection (= rendre visible lorsqu'une substance passe une certaine partie du système de chromatographie ou lorsqu'une substance s'arrête une fois le processus terminé), la chromatographie est inconcevable. Différents systèmes de détection sont utilisés pour chaque type de chromatographie, soit en utilisant les propriétés physiques (absorption de la lumière, fluorescence , diffusion de la lumière , conductivité thermique ) des substances, soit en obtenant un signal par des réactions chimiques. Au moyen de réactions chimiques z. B. Une coloration est obtenue en chromatographie planaire (par exemple, des acides aminés utilisant de la ninhydrine ) ou des réactions sont effectuées avant séparation (dérivatisation pré-colonne) ou après séparation (dérivatisation post-colonne) en chromatographie sur colonne.

En chromatographie préparative, un collecteur de fractions est alors nécessaire pour collecter la substance séparée.

En raison de la conception, les procédés de purification chromatographique sont toujours des procédés par lots. Cela signifie que seule une certaine quantité de substance peut être appliquée et séparée avant de passer à la quantité suivante. Ceci est particulièrement problématique lorsque l'on travaille de grandes quantités, de sorte que certaines méthodes ont été développées pour pouvoir opérer la chromatographie en continu : la chromatographie annulaire, la chromatographie TMB (True Moving Bed) et la chromatographie SMB (Simulated Moving Bed).

Terminologie et principe

État stationnaire

Phase qui interagit avec les substances individuelles du mélange de substances et ne bouge pas. Le séjour des analytes pendant leur rétention alterne entre la phase mobile et stationnaire (marche aléatoire) et provoque le temps de rétention caractéristique de la substance. En chromatographie en phase gazeuse, la phase stationnaire est constituée d'un liquide (liquide de séparation) ou d'un gel dont l'intérieur du capillaire est enduit. En chromatographie liquide, la phase stationnaire est normalement solide, mais il peut aussi s'agir d'un liquide non miscible avec la phase mobile et qui mouille le support pulvérulent . Enfin, la phase stationnaire peut également être constituée de molécules liées chimiquement au support.

Phase mobile

Phase dans laquelle le mélange de substances est introduit au début du système de séparation et qui est déplacé. En chromatographie liquide, la phase mobile est liquide. En chromatographie en phase gazeuse, on utilise des gaz porteurs tels que l' hydrogène , l' hélium ou l' azote ; en chromatographie sur couche mince on parle d' agent d'écoulement . Les phases mobiles diffèrent par leur capacité d'élution ("Strength" voir ci-dessous " Elutrope range "), cela nécessite des temps de rétention différents et souvent aussi des sélectivités différentes.

Rétention

Par rétention, on entend l'écoulement retardé de substances individuelles dans le mélange de substances de la phase mobile par interaction avec la phase stationnaire.

La rétention d'une substance par la phase stationnaire est essentiellement déterminée par trois aspects :

• Force de l'interaction de la substance avec la phase stationnaire ("tendance à rester dans la phase stationnaire")
• Point d'ébullition de la substance ("tendance à rester en phase mobile")
• Propriétés de diffusion de la substance ("mobilité en phase stationnaire et mobile")

Dans de nombreux cas, une interaction particulière entre la substance à analyser et la phase stationnaire est utilisée pour séparer les substances. La force des interactions entre les composants de l'échantillon et la phase stationnaire est déterminée à la fois par leur structure et par leurs groupes fonctionnels. Dans le cas des substances non polaires, seules des interactions de dispersion ( liaisons de van der Waals ) se produisent, tandis que les phases de séparation polaire peuvent également entrer dans des interactions polaires, telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons donneur-accepteur. Ces derniers se séparent selon le principe : les contraires s'attirent. Cela signifie que les phases de séparation qui sont capables d'absorber l'hydrogène pour la liaison hydrogène, par exemple, séparent les substances qui peuvent fournir de l'hydrogène pour la liaison (comme les alcools). Les énantiomères , par exemple , qui ne diffèrent pas par leurs points d'ébullition et auraient donc les mêmes temps de rétention, peuvent également être séparés par leurs interactions de forces différentes avec des dérivés spéciaux de cyclodextrines.

Temps de rétention

Temps nécessaire aux molécules d'une substance pure pour traverser la colonne (de l'injection à la détection).

Contrairement aux gaz vecteurs, la plupart des substances chimiques interagissent avec la phase stationnaire, c'est-à-dire. C'est-à-dire qu'ils restent dans la phase stationnaire pendant un certain temps. La durée de votre séjour en phase stationnaire s'ajoute à la durée de votre séjour en phase mobile (temps mort), il vous faut donc globalement plus de temps pour passer toute la colonne GC. Le terme rétention est à l'origine dérivé du fait que la phase stationnaire retient l'analyte pendant un certain temps. De nos jours, cependant, le terme temps de rétention est utilisé de manière simplifiée pour le temps nécessaire à l'analyte pour traverser la colonne et cela inclut donc le temps mort. Les termes sont donc définis comme suit :

• Temps de rétention ( t _R ) : est le temps total nécessaire à un analyte pour traverser la colonne. Cela correspond au temps entre l'injection et la détection de l'analyte.
• Temps mort ( t ₀ ) : est le temps pendant lequel un analyte reste dans la phase mobile sans interagir avec la phase stationnaire ; correspond ainsi au temps de parcours de la phase mobile dans la colonne.
• Temps de rétention net ou temps de rétention réduit ( t _N ) : C'est la différence entre le temps de rétention et le temps mort. Il correspond donc au temps pendant lequel un analyte est en phase stationnaire. t _N = t _R - t ₀

Temps d'écoulement (temps mort)

Le temps d'écoulement (également "temps mort") indique le temps qu'il faut à la phase mobile ou à une substance non retenue pour traverser l'appareil de chromatographie depuis l'injection via la colonne jusqu'au détecteur (voir aussi volume d'écoulement ). Le temps d'écoulement peut être déterminé en injectant une substance qui n'a pas été retenue (« substance inerte »). Cette substance n'interagit que très faiblement avec la phase stationnaire. Il traverse donc l'appareil en même temps que la phase mobile. Le temps d'écoulement est alors identique au temps d'apparition du pic dans le détecteur.

Débit

Le volume d'écoulement peut être dérivé directement du temps d'écoulement. Il résulte de la formule simple débit volume = débit de la phase mobile · temps d'écoulement. Le volume d'écoulement est très important pour de nombreux calculs en chromatographie liquide haute performance (HPLC), par ex. B. pour le transfert de méthode entre des colonnes de volumes différents.

Élution

(Elution lat . Eluère "wash out") consiste à dissoudre ou déplacer les substances adsorbées à partir d'adsorbants solides ou liquides imprégnés et d'échangeurs d'ions par addition continue d'un solvant ( éluant = phase mobile ). La solution qui s'écoule de la colonne de séparation est appelée éluat .

Ce procédé est particulièrement important dans l'extraction en phase solide .

Série Eluotrope

Disposition des solvants couramment utilisés comme phases mobiles selon leur pouvoir d'élution dans le cas d'une substance de référence (généralement gel de silice ou oxyde d'aluminium).

Fleurs

Lors de la purge, un effet sur les colonnes de chromatographie est mentionné, dans lequel la colonne perd de petites quantités de sa matrice. On parle aussi de saignement de colonne. En chromatographie en phase gazeuse, la cause d'un saignement accru de la colonne peut être une charge thermique excessive sur la colonne et, en chromatographie liquide à haute performance (HPLC), l'utilisation, par exemple, de valeurs de pH inadaptées de l'éluant ou des éluants ( trop fortement acide ou alcalin). Le ressuage de la colonne se produit dans une moindre mesure pendant le fonctionnement et n'y est normalement pas un problème.Le ressuage de la colonne entraîne, entre autres, le vieillissement des colonnes de séparation. Cependant, un saignement important de la colonne provoque beaucoup de bruit de signal et une valeur de fond élevée lors des méthodes de détection ou d'analyse en aval, telles qu'un spectromètre de masse .

pilier

En chromatographie, une colonne , ou colonne de séparation , est un tube creux d'un diamètre de quelques micromètres à plusieurs mètres. La longueur varie également de quelques centimètres à 150 mètres. Dans ce tube, soit seule la paroi interne est revêtue (colonne capillaire), soit la colonne est remplie de la phase stationnaire (colonne garnie). Il diffère de la colonne dans la construction en ce qu'il n'a pas besoin d'être droit ou vertical, mais peut également être enroulé comme un tuyau.

Mécanisme de phase inversée

Il existe deux manières de séparer un mélange de substances en chromatographie d'adsorption :

1. Phase normale : phase stationnaire polaire (telle que gel de silice , oxyde d'aluminium), phase mobile non polaire à moyennement polaire (telle que hydrocarbures, dioxane, acétate d'éthyle...) ou
2. Phase inversée : phase stationnaire non polaire (comme le gel de silice modifié) et phase mobile polaire (comme l'eau tamponnée).

Dans le premier cas, les substances lipophiles sont facilement éluées, les substances polaires sont difficiles, dans le cas inverse les substances polaires sont facilement éluées ("similia similibus solvuntur").

En chromatographie liquide à haute performance , l' élution en gradient est souvent utilisée, dans laquelle la composition du solvant est lentement modifiée (par exemple, de 80% à 20% de teneur en eau). Les alcanes émergent de la colonne très tardivement et les acides aminés émergent très tôt, et ces fractions peuvent être découpées.

Classification selon le principe de séparation

Le principe fondamental de tous les procédés chromatographiques est l'établissement souvent répété d'un équilibre entre une phase stationnaire et une phase mobile. L'équilibre peut se développer en raison de divers effets physico-chimiques.

• Chromatographie d'adsorption - les différents composants sont séparés en raison des différentes forces des liaisons d'adsorption à la phase de repos. La phase mobile peut être un solvant plus ou moins polaire ou, dans le cas de substances gazeuses, un gaz porteur. Dans le cas de la chromatographie liquide , on imagine une compétition entre les différentes molécules de l'échantillon et les molécules de la phase mobile (solvant, solvant) pour les points d'adhésion sur la (grande) surface de la phase stationnaire.
• Chromatographie de partage - similaire au processus d'extraction , la solubilité différente des composants à séparer est utilisée ici. Dans le cas de la chromatographie, cependant, le solvant reste sous forme de phase statique sur un matériau support. La phase mobile peut encore être une solution ou un gaz porteur.
• Chromatographie d'échange d'ions - la phase mobile est principalement une solution des ions à séparer. La phase de repos est un échangeur d'ions solide. Les échangeurs d'ions forment des liaisons de stabilité différente entre les différents ions de la phase mobile.
  • La chromatographie avec agent chélatant est une forme spéciale de chromatographie échangeuse de cations. La phase de repos se lie sélectivement aux cations polyvalents via des groupes fonctionnels formant des complexes. La sélectivité pour les ions de métaux lourds par rapport aux ions alcalins et alcalino-terreux est élevée.
• Effet de tamisage - Dans la phase de repos, des substances sont utilisées qui séparent les composants en fonction de leur taille. Essentiellement, une distinction est faite entre trois méthodes.
  • Chromatographie sur tamis moléculaire
  • Chromatographie par perméation de gel (filtration sur gel)
  • Chromatographie d'exclusion

Avec un tamis, les particules ont des « avantages » suffisamment fins pour pénétrer les pores du tamis. C'est exactement le contraire avec les procédés de chromatographie correspondants. Des particules suffisamment fines sont capables de "se perdre" dans les cavités de la phase stationnaire et donc de voyager plus lentement que les molécules qui sont exclues de ces cavités (plus ou moins ou entièrement) en raison de leur taille. S'ils sont de taille suffisante, ils migrent sans délai, car ils ne restent que dans le flux de liquide en mouvement et jamais dans la partie stationnaire du liquide (dans les cavités - le gel par exemple).

• Chromatographie d'affinité - Un composé chimique spécifique à chaque analyte est utilisé comme phase stationnaire, ce qui provoque une séparation due à des forces non covalentes. C'est une méthode très sélective.
  • IMAC (Chromatographie d'affinité avec ions métalliques immobilisés) - Ions métalliques tels que Fe, Co, Ga, etc. lié à une matrice. La séparation est réalisée via les différentes interactions entre l'analyte et les ions métalliques. Cette méthode s'est imposée notamment dans la purification de protéines par phosphorylation . Fe et Ga sont principalement utilisés comme ions métalliques. Depuis quelque temps, l'enrichissement à l'aide de colonnes de dioxyde de titane s'avère être un procédé compétitif. Diverses méthodes IMAC sont également disponibles pour la purification de protéines marquées à la polyhistidine. Surtout, les ions Ni et Co sont utilisés pour l'enrichissement.
• La chromatographie d'échange thiol - disulfure utilise des groupes thiol fermement liés sur la phase de repos afin de lier de manière réversible les groupes thiol sur les molécules dans la phase mobile sous forme de disulfures covalents. Les groupes thiol situés à l'extérieur des molécules de protéine participent principalement à ces liaisons.
• Chromatographie chirale - Pour la séparation de molécules chirales . La phase stationnaire contient un énantiomère qui entre dans une interaction diastéréomère de différentes forces avec les deux énantiomères du racémate . Les deux énantiomères sont retardés à des degrés différents.

Classement selon les phases utilisées

En raison des phases mobiles, la chromatographie peut être divisée en trois zones, qui peuvent être divisées en fonction des porteurs des phases stationnaires ou de la densité

• Chromatographie liquide (Engl. Liquid Chromatography, LC)
  • Chromatographie planaire
    • Chromatographie sur papier - La phase solide utilisée est du papier couché ou (principalement) debout verticalement dans un récipient en verre. Comme pour la chromatographie sur couche mince, la phase mobile est déplacée en raison des forces capillaires .
    • Chromatographie sur couche mince - La phase solide est par ex. B. particules de silice appliquées en fine couche sur un film support souple en aluminium ou en plastique ou sur une plaque de verre. Une variante est la CCM circulaire, avec un disque circulaire rotatif revêtu (particulièrement adapté à des fins de préparation).
  • Chromatographie sur colonne
    • Chromatographie basse pression - Les colonnes utilisées ici ont un diamètre d'un à plusieurs centimètres. Cette forme de chromatographie liquide est principalement utilisée pour les séparations préparatives.
    • Chromatographie liquide haute performance (le terme chromatographie haute pression est incorrect, mais il est également très courant; chromatographie liquide HPLC haute performance (pression)) - Elle représente la méthode de séparation la plus largement utilisée en analyse aujourd'hui, la méthode réellement incorrecte (obsolète) Le terme chromatographie liquide à haute pression fait référence aux pressions qui distinguent cette méthode de la chromatographie à basse pression ou d'autres types de chromatographie. Après tout, jusqu'à plus de 1000 bars sont générés ici à un débit de la phase mobile allant jusqu'à 5 ml / min, ce qui n'a cependant rien à voir avec les performances de séparation, mais sert uniquement à déplacer le mélange d'éluant dans le colonne.
    • Electrochromatographie - Dans ce cas, la phase mobile est déplacée en appliquant une tension. Cette méthode est encore en phase de développement et n'est pas utilisée en routine. A ne pas confondre avec électrophorèse .
  • Chromatographie membranaire
    • Au lieu d'une colonne remplie d'une matrice chromatographique, une membrane monocouche ou multicouche est utilisée comme phase solide dans un boîtier approprié. La phase mobile est pompée à travers la membrane à des pressions basses allant jusqu'à 6 bars et à des débits environ 20 fois plus élevés que ce qui est habituel en chromatographie sur colonne.
• Chromatographie des gaz
  • Colonnes remplies - L'intérieur d'une colonne (tube long) est rempli d'un matériau à grain fin. En règle générale, la phase stationnaire est constituée d'un mince film d'un liquide largement inerte et à haut point d'ébullition qui enrobe les grains de poudre.
  • Colonnes capillaires - seule la paroi de la colonne est recouverte d'une fine couche de phase stationnaire.
    • Phase stationnaire liquide
    • Phase stationnaire solide
• Chromatographie en fluide supercritique ( chromatographie en fluide supercritique SFC) - Une substance dans sa phase supercritique (état entre gaz et liquide) est utilisée comme phase mobile. Il s'agit principalement de dioxyde de carbone. Dans cette méthode, seules les colonnes sont utilisées pour supporter les phases stationnaires.

Caractéristiques de la chromatographie

• Longueur de colonne ${\ style d'affichage L}$

• Temps d'écoulement ${\ style d'affichage t_ {0}}$

• Temps de rétention ${\ displaystyle t_ {R}}$

• ${\ displaystyle u}$est appelé débit linéaire de la phase mobile à travers la colonne, il est défini comme :

${\ displaystyle u = {\ frac {L} {t_ {0}}}}$

• le facteur de rétention est défini par${\ style d'affichage k}$

${\ displaystyle k = {\ frac {t_ {R} -t_ {0}} {t_ {0}}}}$

• Le coefficient de sélectivité indique la qualité de la séparation de deux substances. Il est basé sur les temps de rétention des composants dans la colonne. Le temps de rétention est le temps nécessaire au composant considéré pour traverser la colonne et est affiché au pic maximum :${\ displaystyle t_ {R}}$

${\ displaystyle \ alpha = {\ frac {k_ {2}} {k_ {1}}}}$

• ${\ style d'affichage R}$Cette résolution chromatographique ( Résolution ) de deux pics calculée comme suit :

${\ displaystyle R = 2 \ cdot \ left ({\ frac {t_ {R2} -t_ {R1}} {b_ {B2} + b_ {B1}}} \ right)}$ ou alors

${\ displaystyle R = 1 {,} 18 \ cdot \ left ({\ frac {t_ {R2} -t_ {R1}} {FWHM_ {1} + FWHM_ {2}}} \ right)}$

Le facteur 1,18 résulte du rapport entre la demi-largeur et la largeur de base d'une courbe en cloche gaussienne ((2 · ln 2) ^0,5 ).

• ${\ style d'affichage N}$, le nombre de plateaux ou de plateaux décrit le nombre de réglages d'équilibre de la substance à séparer entre la phase stationnaire et mobile dans la colonne. Plus N est grand, plus les ajustements d'équilibre peuvent être effectués sur une certaine longueur, ce qui se traduit par une meilleure performance de séparation de la colonne. N est calculé à l'aide de la formule :

${\ displaystyle N = 16 \ cdot \ left ({\ frac {t_ {R}} {b_ {B}}} \ right) ^ {2} (2 ^ {2} \ cdot 4 = 16)}$ ou alors

${\ displaystyle N = 5 {,} 55 \ cdot \ left ({\ frac {t_ {R}} {FWHM}} \ right) ^ {2} (1 {,} 18 ^ {2} \ cdot 4 = 8 \ cdot \ ln 2 = 5 {,} 54)}$

${\ displaystyle b_ {B}}$ : Largeur de la ligne de base

${\ style d'affichage FWHM}$ : "Pleine largeur à mi- hauteur " Fwhm

• ${\ style d'affichage n}$: Capacité de pointe ; Indique combien de pics dans un intervalle entre et la valeur k d'un certain pic peuvent théoriquement être séparés les uns des autres avec une résolution de R = 1,5 (séparation de la ligne de base).${\ style d'affichage t_ {0}}$

${\ displaystyle n = 1 + {\ frac {\ sqrt {N}} {4}} \ cdot \ ln (1 + k _ {\ text {max}})}$

• ${\ style d'affichage H}$désigne la hauteur de plateau (ou hauteur de plateau théorique ) d'un plateau théorique (HETP -, hauteur équivalente d'un plateau théorique ", anglais , hauteur équivalente à un plateau théorique" ) et la relation entre la longueur de colonne et le nombre de plateaux :${\ style d'affichage L}$${\ style d'affichage N}$

${\ displaystyle H = {\ frac {L} {N}}}$

Les valeurs pratiques sont comprises entre 0,1 et 0,5 mm.

Hauteur de séparation H

La hauteur de l'étage de séparation d'une colonne chromatographique est une mesure de l'efficacité de séparation de la colonne. La section imaginaire de la colonne de séparation sur laquelle s'établit l'équilibre chromatographique peut être imaginée comme l'étape de séparation. Plus ces réglages d'équilibre « ont de l'espace sur la colonne », plus la hauteur de l'étage de séparation est faible et plus l'efficacité de séparation de la colonne est élevée. Pour atteindre une faible hauteur de plaque dans des conditions analytiques , les prérequis suivants sont nécessaires :

1. Un équilibre rapide d'adsorption ou de distribution est attendu. Par conséquent, le diamètre des particules doit être aussi petit que possible.
2. Température constante dans toute la colonne. Un thermostat à colonne peut être utilisé pour cela.
3. Débit constant : Une pompe à piston jusqu'à 400 bar est utilisée pour cela.
4. Plage d'adsorption linéaire : La phase stationnaire ne doit pas être surchargée au cours de la chromatographie.
5. Une diffusion négligeable serait souhaitable, mais ne peut malheureusement pas être réalisée expérimentalement. Par conséquent, des garnissages aussi réguliers que possible avec des particules de diamètre particulièrement petit sont utilisés.

L' équation dite de Van Deemter pour la chromatographie liquide haute performance permet de déterminer la hauteur de l'étage de séparation en fonction du débit de l'éluant :

${\ displaystyle H = A + {\ frac {B} {u_ {x}}} + C \ cdot u_ {x}}$

dans lequel:

• ${\ style d'affichage H}$ la hauteur du pas de séparation,
• ${\ displaystyle u_ {x}}$ est le débit linéaire.
• ${\ style d'affichage A}$-Terme prend en compte la diffusion turbulente , qui est causée par différents chemins d'écoulement à travers le garnissage. Ce qui suit s'applique : où ${\ displaystyle A = 2 \ cdot p \ cdot d}$
  • ${\ style d'affichage p}$ le facteur d'emballage,
  • ${\ style d'affichage d}$ désigne le diamètre des particules.
• Le terme prend en compte la diffusion longitudinale. La diffusion longitudinale est la diffusion des molécules d'analyte dans les deux sens de l'étape de séparation. Ce qui suit s'applique : où : ${\ style d'affichage B}$${\ displaystyle B = 2 \ fois D \ fois L}$
  • ${\ style d'affichage D}$ la constante de diffusion dans la phase mobile et
  • ${\ style d'affichage L}$est le facteur labyrinthe. Le facteur labyrinthe prend en compte la structure des pores de la phase stationnaire.
• le terme prend en compte l' élargissement du pic dû à la lente mise en place de l'équilibre entre les phases mobile et stationnaire. La constante de diffusion le long des pores de la phase stationnaire doit également être prise en compte. Ça s'applique${\ style d'affichage C}$${\ displaystyle D_ {s}}$${\ displaystyle C = {\ frac {\ frac {t_ {s}} {t_ {m}}} {(1 + {\ frac {t_ {s}} {t_ {m}}}) ^ {2}} } \ cdot {\ frac {d ^ {2}} {D_ {s}}}}$

Pic de symétrie

Théoriquement, chaque substance devrait quitter une colonne de chromatographie sous la forme d'une ligne d'élution nette. Pour diverses raisons, cependant, les pics chromatographiques ont toujours une certaine largeur. Dans le cas idéal, ils ont la forme d'une courbe en cloche gaussienne. En pratique, cependant, il arrive souvent que les pics s'écartent de cette forme idéale et apparaissent plus ou moins asymétriques. Une asymétrie dans laquelle la montée du front du pic est plus raide que la chute du pic est appelée « tailing », tandis que l'effet selon lequel la montée est moins raide que la chute est appelé « fronting » ou « lead ». Le facteur de traînée, qui est une mesure de la symétrie du pic, est déterminé en abaissant la perpendiculaire du maximum du pic à la ligne de base, et à une certaine hauteur, généralement 10 % de la hauteur du pic, les distances jusqu'au front du pic (a) et jusqu'au pic (b) déterminé. Le quotient des deux valeurs est alors formé, avec différentes formules de calcul (par exemple selon IUPAC ou USP ) étant utilisées :

Un « pic de Gauss » idéal atteint la valeur 1, les valeurs supérieures à 1 signifient « tailing », tandis que les valeurs inférieures à 1 signifient « fronting ».

Procédure

• Chromatographie liquide
  • Chromatographie sur couche mince
  • Chromatographie sur papier
  • Chromatographie sur colonne
    • Chromatographie par perméation de gel
    • Chromatographie d'échange d'anions
• Chromatographie des gaz
• Chromatographie frontale
• Chromatographie multidimensionnelle

Littérature

• Karl Kaltenböck : Chromatographie pour débutants , Weinheim : Wiley-VCH-Verlag, Weinheim 2008, ISBN 978-3-527-32119-3 .
• Haleem J. Issaq (Ed.): A Century of Separation Science , Marcel Dekker, New York 2002, ISBN 0-8247-0576-9 ( partiellement accessible en ligne via Google Books , volume complet sur l'histoire de la chromatographie)
• Andreas Heintz : Thermodynamique des mélanges . Springer-Verlag GmbH, Allemagne 2017, ISBN 978-3-662-49923-8 , 1.17 Théorie thermodynamique de la chromatographie, page 78 et suivantes . 

liens web

• Chimie analytique - chromatographie sur chemgapedia.de
• Aperçu complet des fabricants de systèmes LC
• Termes chromatographiques allemands de base pour la nomenclature IUPAC ( Memento du 10 juillet 2007 dans Internet Archive )