Technique d'hybridome
La technologie des hybridomes (aussi : hybridome technologie ou technologie des hybridomes) est un procédé de production d' anticorps monoclonaux (mAK ou en anglais mAB pour « Molecular Anticorps »). Il a été développé en 1975 par César Milstein et Georges Köhler , pour lesquels les deux chercheurs ont reçu le prix Nobel de médecine en 1984 .
Propriétés
Dans la technique de l'hybridome, les cellules productrices d'anticorps (cellules B ) sont fusionnées avec des cellules de myélome ( cellules cancéreuses ) , ce qui donne des hybrides quasi-immortels qui produisent des anticorps monoclonaux. Étant donné que les cellules B ont une durée de vie limitée, une culture efficace dans des conditions de laboratoire n'est pas possible. Les cellules myélomateuses, quant à elles, sont des cellules fortement dérégulées qui ne sont pas sujettes à la mort cellulaire programmée ( apoptose ). En fusionnant les deux types cellulaires, leurs propriétés peuvent être combinées sous la forme de cellules dites hybridomes. Ceux-ci sont désormais capables de sécréter des anticorps monoclonaux sans restriction . Cette technique a permis de produire des anticorps en grande quantité et avec une spécificité sur mesure . Les principaux domaines d'application des anticorps monoclonaux sont les produits pharmaceutiques, le diagnostic et la recherche. L'organigramme suivant résume les processus impliqués dans la technique de l'hybridome (voir également la figure 1) :
- Immunisation (ex . : souris )
- Culture de cellules de myélome
- Obtention des cellules B ( rate )
- Fusion cellulaire
- Sélection de cellules d'hybridomes (sélection HAT)
- Dépistage des cellules compétentes sécrétant des anticorps ( ELISA )
En variante, le virus d'Epstein-Barr can pour l' immortalisation des cellules B est utilisé.
immunisation
La première étape de la production de cellules d'hybridomes est l'immunisation des organismes donneurs afin d'obtenir à partir d'eux des cellules B appropriées . Des lignées consanguines de souris spécialement sélectionnées (lignée BALB / c) sont généralement utilisées pour cela, car elles sont peu sensibles aux maladies. Des systèmes pour humains, lapins, rats et chèvres sont également disponibles. Pendant l'immunisation, de petites doses d'un antigène ( vaccin ) sont généralement administrées à plusieurs reprises à l'organisme donneur . En raison de la réponse immunitaire naturelle , davantage de cellules B se forment qui sécrètent des anticorps contre cet antigène. Le déroulement exact d'une immunisation dépend de l'organisme présent et de l'antigène à administrer et ne peut souvent être déterminé qu'empiriquement. Une valeur indicative pour l'immunisation des souris est z. B. l'administration de 100 µg d'antigène et 300 µl de tampon PBS . Pour augmenter les chances de succès, trois animaux ou plus sont généralement utilisés en même temps. La rate est prélevée sur l'animal quatre jours après la dernière immunisation, car un nombre particulièrement important de cellules B s'accumule dans cet organe. C'est ce qui est finalement obtenu au moyen d'une centrifugation à gradient de densité . Dans le même temps, les cellules de myélome qui ont perdu leurs fonctions spécifiques à la cellule (par exemple la production d'anticorps) sont cultivées dans des cultures cellulaires. Les cellules cancéreuses des plasmocytes se sont avérées particulièrement appropriées , car les signaux apoptotiques sont ici complètement ignorés. Après la fusion cellulaire, ils assurent seulement la prolifération sans restriction des cellules d' hybridome. Il s'est également avéré avantageux d'utiliser le myélome et les cellules B du même organisme, car cela augmente la stabilité des cellules d'hybridome.
Fusion cellulaire
Essentiellement, deux méthodes de fusion cellulaire se sont établies : (1) l'exposition à des substances chimiques ( polyéthylène glycol ; PEG) ou (2) le traitement utilisant la tension électrique ( électrofusion ). Dans la première méthode, les cellules B et les cellules de myélome sont rassemblées dans la solution de fusion et centrifugées . L'eau présente étant en grande partie liée par le polyéthylène glycol, les membranes cellulaires sont mises en contact étroit les unes avec les autres, ce qui conduit à une fusion spontanée des membranes cellulaires. Le PEG ayant un effet toxique sur les cellules, la concentration et le temps d'exposition de la solution de PEG sont d'une importance décisive pour le succès de la fusion. En électrofusion, la membrane cellulaire est localement "fondue" au moyen d'impulsions électriques (cf. électroporation ), ce qui provoque la fusion des membranes cellulaires. Pour soutenir la fusion, le PEG est généralement ajouté en petites quantités ici aussi. Après la fusion, des cellules qui ont deux ou plusieurs noyaux cellulaires ( hétérocaryon ) apparaissent, entre autres . Pour devenir une cellule d'hybridome intacte, ces noyaux doivent fusionner spontanément. Étant donné que les chromosomes sont souvent éliminés au cours de ce processus , seule une très petite proportion des cellules d'hybridome reste stable.
Sélection de cellules d'hybridomes
Après la fusion cellulaire, cinq types cellulaires sont présents dans la solution :
- Cellules d'hybridome
- cellules spléniques non fusionnées
- cellules de myélome non fusionnées
- cellules spléniques fusionnées
- cellules de myélome fusionnées
Afin de sélectionner des cellules d'hybridome qui produisent réellement des anticorps (monoclonaux), un milieu sélectif est utilisé dans lequel seules les cellules d'hybridome sont capables de survivre. Un milieu approprié est le milieu dit HAT, qui contient de l' hypoxanthine , de l' aminoptérine et de la thymidine . L'hypoxanthine est un précurseur de molécules essentielles ( purines ) nécessaires à la construction de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Pour le convertir, cependant, l'enzyme HGPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase) est nécessaire. Etant donné qu'une lignée cellulaire de myélome dépourvue de cette enzyme ou sous une forme inactive est utilisée dans la fusion, les cellules de myélome individuelles ne peuvent pas survivre dans ce milieu. Les cellules spléniques, d'autre part, ont HGPRT, mais ne sont pas capables de survivre par elles-mêmes et de mourir rapidement dans le milieu de culture. Seules les cellules d'hybridomes peuvent être cultivées car elles ont l' immortalité des cellules myélomateuses et les gènes HGPRT des cellules spléniques. L'aminoptérine sert uniquement à bloquer d'autres voies de synthèse des purines. Puisque cela signifie que la thymine essentielle ne peut plus être produite de novo , elle doit être ajoutée au milieu (voir aussi synthèse de pyrimidine de novo ). Cependant, à partir des cellules d'hybridome ainsi sélectionnées, les clones qui produisent les anticorps souhaités doivent encore être isolés ( criblage ). Cela se fait de préférence à l' aide d' un test ELISA (test immuno-enzymatique). Les anticorps sont incubés avec l'antigène contre lequel ils doivent effectivement être dirigés. Une correspondance est prouvée par une réaction de couleur enzymatique. Si vous obtenez après une sélection HAT z. Par exemple, plusieurs dizaines de milliers de clones, il n'est pas rare que seulement quelques centaines de cellules produisent les anticorps souhaités. Après une nouvelle culture, seules quelques dizaines de cellules d'hybridome restent souvent stables. Certains des clones positifs sont stockés dans de l' azote liquide pour une utilisation ultérieure , tandis que les cellules restantes sont davantage cultivées. Ces cultures d'hybridomes atteignent des rendements allant jusqu'à 1 mg mAb/ml.
Littérature
- AE Campbell : Technologie des anticorps monoclonaux. Elsevier, 1987, ISBN 0-444-80592-3 .
- William Davis : Protocoles d'anticorps monoclonaux . Humana Press, 1995, ISBN 0-89603-308-2 .
- Peter Bösch : Étude de cas sur la production d'anticorps monoclonaux. Mémoire de maîtrise Univ. pour la culture du sol, Vienne 2007.
- G. Köhler, C. Milstein : Cultures continues de cellules fusionnées sécrétant des anticorps de spécificité prédéfinie. Dans : Nature. Tome 256, 1975, p. 495-497.
- S. Shirahata, Y. Katakura, K. Teruya : Hybridation cellulaire, hybridomes et hybridomes humains. In : Méthodes en biologie cellulaire. Tome 57, 1998, p. 111-145.
- SP Cole, BG Campling, T. Atlaw, D. Kozbor, JC Roder : Anticorps monoclonaux humains. In : Biochimie moléculaire et cellulaire. Volume 62, 1984, pages 109-120.
- MR Clark : Anticorps monoclonaux dérivés de myélomes hybrides. Dans : La Ricerca in clinica e in laboratorio. Tome 11 (3), 1981, p. 195-203.
Preuve individuelle
- ↑ https://edoc.rki.de/handle/176904/5376
- ↑ E. Traggiai, S. Becker, K. Subbarao, L. Kolesnikova, Y. Uematsu, MR Gismondo, BR Murphy, R. Rappuoli, A. Lanzavecchia : neutralisation puissante : une méthode efficace pour fabriquer des anticorps monoclonaux humains à partir de cellules B mémoire du coronavirus du SRAS. Dans : Médecine de la nature . Volume 10, numéro 8, août 2004, ISSN 1078-8956 , pp. 871-875, doi : 10.1038 / nm1080 , PMID 15247913 .